Cependant, lorsque les spectres d’émission se chevauchent, la fluorescence de plus d’un fluorochrome peut être détectée. Pour corriger ce chevauchement spectral, un processus de compensation de fluorescence est utilisé. Cela garantit que la fluorescence détectée dans un détecteur particulier dérive du fluorochrome qui est mesuré.
Pourquoi avons-nous besoin d’une compensation en cytométrie en flux ?
Une compensation est nécessaire pour une expérience de cytométrie en flux en raison de la physique de la fluorescence. Un fluorochrome est excité et émet un photon dans une gamme de longueurs d’onde. Certains de ces photons se répandent dans un deuxième détecteur, ce qui fait apparaître des échantillons colorés uniques doublement positifs.
Quel est le but principal de l’utilisation d’une cellule de compensation ?
L’objectif principal est de permettre la mesure de la vraie fluorescence dans le canal primaire contaminé par le débordement des fluorophores voisins. Par conséquent, la compensation corrige l’« intrusion » de fluorescence entre les fluorophores. Cependant, il n’est pas parfait et ne peut pas corriger tous les effets indésirables.
Qu’est-ce que la matrice de rémunération ?
Une matrice de compensation est calculée à l’aide de fichiers de contrôle fluorescents monochromes qui sont collectés sur ImageStream ou FlowSight avec tous les canaux collectés et en l’absence d’éclairage en fond clair ou SSC.
Qu’est-ce que la compensation spectrale ?
L’utilisation de la compensation spectrale signifie que le signal des détecteurs non primaires est toujours utilisé pour améliorer le vrai signal des marqueurs lorsque cela est possible. Les échantillons de contrôle primaires sont utilisés pour la dénomination des paramètres. Les échantillons utilisés pour les détecteurs primaires aident également à nommer ces paramètres après la compensation spectrale.
Comment vérifier ma rémunération FlowJo ?
1) en double-cliquant sur le badge de compensation dans la fenêtre de l’espace de travail (tout échantillon compensé a ce badge à côté de l’échantillon dans la colonne de gauche en bas de l’espace de travail.) 2) en cliquant sur le bouton « Afficher la matrice… » dans la fenêtre principale de Compensation .
Comment utilisez-vous la compensation FlowJo ?
1) Pour lancer la création d’une nouvelle matrice de rémunération dans FlowJo, sélectionnez le groupe de rémunération dans l’espace de travail et accédez au ruban de l’espace de travail. 2) Cliquez sur l’icône de compensation dans la bande Cytométrie de l’onglet Outils. 3) L’interface de compensation se lancera.
Comment puis-je demander une indemnisation dans le FACS ?
Procédure générale
Assurez-vous que le cytomètre fonctionne selon les spécifications en utilisant des billes standard.
Réglez les tensions pour les canaux de fluorescence à l’aide d’un échantillon non coloré.
Certaines combinaisons de fluorochromes doivent être évitées si possible (par exemple APC et PE-Cy5), étant donné le degré élevé de chevauchement des émissions.
Comment fonctionne la compensation FACS ?
Le terme «compensation», tel qu’il s’applique à l’analyse par cytométrie en flux, fait référence au processus de correction du débordement de fluorescence, c’est-à-dire la suppression du signal d’un fluorochrome donné de tous les détecteurs sauf celui consacré à la mesure de ce colorant.
Qu’est-ce que le FITC et le PE ?
La norme de compensation FITC / PE doit être utilisée conjointement avec du matériel ou un logiciel pour supprimer le chevauchement spectral des fluorochromes dans les détecteurs de fluorescence secondaires d’un cytomètre en flux. Le standard de compensation FITC/PE est un mélange de 4 populations de microsphères : FITC, PE, FITC/PE et AutoFluor™.
Comment fabrique-t-on des perles de compensation ?
Procédure expérimentale
Étiquetez un tube pour chaque fluorochrome qui sera utilisé dans l’expérience.
Mélanger les billes en inversant vigoureusement au moins 10 fois ou en pulsant au vortex.
Étiquetez chaque tube et pulsez le vortex 10 fois.
Ajouter 1 goutte d’UltraComp eBeads dans chaque tube.
Ajouter 1 test ou moins de conjugué d’anticorps dans chaque tube et mélanger.
Pourquoi utilise-t-on la cytométrie en flux ?
La cytométrie en flux fournit une méthode bien établie pour identifier les cellules en solution et est le plus souvent utilisé